多发性骨髓瘤MM新进展（模型建立）

背景部分介绍：

多发性骨髓瘤(MM)是一种骨髓(BM)浆细胞(PCs)的肿瘤，其分泌单克隆免疫球蛋白，诱导多器官损伤。MM主要发生在老年人中，前兆阶段包括两种类型，一种称为意义不明的单克隆γ病(MGUS)；另一种是MGUS向MM进展的一个过渡阶段，称为阴燃型多发性骨髓瘤(SMM)。了解从前驱疾病发展为临床活动性MM的机制可能有助于对特定人群实施早期治疗。

遗传异质性是MM的一个标志。免疫球蛋白编码基因的染色体易位和高二倍体被认为是早期遗传事件，随后是NF-κB、MAPK-RAS和凋亡通路的异常，从而促进wan全恶性MM表型。晚期遗传改变通常涉及MYC和TP53基因，这些基因在复发/难治性MM中通常发生改变。根据遗传特征，多发性骨髓瘤被分为不同的风险组，表现出不同的标准治疗结果。在这种情况下，原发性遗传病变的获得顺序，以及它们如何促进MM从前体状态进展，尚未wan全阐明。除了遗传学，越来越多的证据表明，肿瘤PCs的存活在很大程度上取决于它们所在的骨髓造血细胞生态位的相互作用。因此，肿瘤抑制微环境提供了有效的监测，以限制MGUS和SMM阶段的PC生长，而进行性免疫编辑导致T细胞衰竭是MM转化的基础。然而，在进展过程中，遗传多样性的肿瘤细胞与基底细胞微环境相互作用以逃避免疫监视的机制在很大程度上是未知的。

解决这些科学问题具有临床意义，因为尽管MM的生存率不断提高，但治愈仍然难以捉摸，大多数MM患者最终会复发。单克隆抗体免疫治疗新策略，T细胞接合剂和嵌合抗原受体T细胞疗法有望更长期地控制MM，这可能最终导致治愈。然而，这种治疗效果与MM患者对免疫检查点抑制剂的低应答率形成鲜明对比。迫切需要破解不同免疫治疗方法差异结果背后的机制。然而，由于缺乏能够概括MM的主要临床、遗传和免疫学特征的实验小鼠模型，这项研究受到了严重的阻碍。在这种情况下，在小鼠中产生MM的主要障碍是不确定疾病的起源细胞和启动和维持转化过程的关键遗传驱动因素。缺乏小鼠MM模型限制了临床前免疫治疗研究，这构成了当前未满足的医疗需求。

在这里，作者介绍了15种基因工程小鼠模型，这些模型反映了该疾病发病机制的关键因素：遗传异质性，MGUS和SMM状态向临床活动性疾病的进展转变，以及肿瘤细胞在转化过程中与BM免疫微环境的相互作用。研究结果表明，MYC是遗传异质性MM肿瘤和免疫进展的关键调节因子，它决定了免疫治疗的临床反应。

主要结果总结：

●对多发性骨髓瘤相关重要驱动因子进行小鼠模型的建立

●通过转录组分析揭示疾病进展的SMUG、SMM、MM时期相关性及具有疾病促进作用重要基因MYC的功能

●MAPK-MYC轴对MM的调控

●MM进展过程中发生了BM微环境重塑（T cell，NK cell浸润）

●MM的遗传异质性导致对ICB治疗响应的不同

●提出CD8+T/Treg，作为检测及评估治疗的生物标志物

结果具体介绍：

1.小鼠多发性骨髓瘤的遗传异质性建模

为了建立遗传多样性MM的临床前模型，将携带8种MM遗传驱动因子的转基因小鼠培育成具有单、双和三重遗传改变的工程菌株，这些基因驱动因子概括了人类MM中最常见的变，其中包括通过IKBKB/IKK2表达激活NF-κB信号，KRASG12D突变，抗凋亡BCL2表达，c-MYC表达，TP53缺失，以及分别模拟免疫球蛋白易位t(11;14)， t(16;14)和t(4;14)的cyclin D1, c-MAF和MMSET/NSD2的组成性表达。用绵羊红细胞(SRBC)免疫幼鼠，然后监测小鼠12个月大时MM的发育情况a。其中3个系显示BM中wan全渗透的PC肿瘤，这缩短了中位总生存期(mOS)至12个月以下，其中两种小鼠系被命名为MImb1和MIcγ1，因为它们分别通过mb1-cre或cγ1-cre等位基因表达MYC和IKK2NF-κB，第三个小鼠系被命名为BIcγ1，因为它通过cγ1-cre等位基因表达了BCL2和IKK2NF-κB b。3种不同细胞系的BM肿瘤由>10% GFP+CD138+B220−sIgM−PCs组成，形态与人MM细胞相似，在BM内呈多灶浸润模式;它们也表达典型的MM标记，包括酸性磷酸酶、Bcma、Slamf7和Taci，分泌免疫球蛋白到血清中，并表现出克隆性IghV基因重排c-f。然而，虽然BIcγ1和MIcγ1菌株主要分泌IgG或IgA，但来自未成熟前b细胞的MImb1小鼠出现IgM分泌表型g。

为了构建MM遗传异质性，将BIcγ1和MIcγ1小鼠与携带其他MM遗传变化的种系杂交，这些遗传异常均缩短了BIcγ1和MIcγ1小鼠的MM发育时间，诱导了一种由GFP+CD138+B220- sIgM- PCs组成的BM疾病，分泌IgG或IgA，并被归类为MM h-i。接下来，确定小鼠模型是否会像人类一样，在出现MM症状之前就存在前体疾病。在BIcγ1和其衍生的小鼠中，形成致命MM前，在6个月大的时候均经过了MGUS样阶段，其特征是很少有寡克隆GFP+CD138+B220- sIgM- PCs浸润的BM，这些细胞适度地向血清中分泌类型转换的免疫球蛋白k-l。

2. 小鼠多发性骨髓瘤的转录和基因组分析

为了确定正常BM PC的共同转录特征，对模型小鼠的MGUS和MM期细胞进行RNA-seq， PC基因包括(Prdm1、Irf4、Xbp1、Sdc1编码Cd138、Tnfrsf17编码Bcma、Tnfrsf13b编码Taci和Slamf7)的上调和B细胞基因的下调a。为了比较小鼠肿瘤与人类疾病，将RNA-seq应用于新诊断的MGUS和MM患者的恶性PCs，以确定与正常BM PCs相比的转录特征。利用主成分分析(PCA)，发现小鼠和人类MGUS细胞定位在PC和MM之间，这表明它们具有相似的进化转录轨迹b。对比发现，BIcγ1来源的小鼠表现出线性的转录进化，从BM细胞到MGUS细胞再到MM细胞，与晚期进展一致。而MIcγ1小鼠的MGUS和MM细胞紧密聚集，差异表达基因数量减少，与快速进展一致c。比较两种模型发现，MYC在MM期表达较高，但在BIcγ1小鼠的MGUS期表达却相对很低d。MM转录组的GSEA发现“MYC靶基因"在两种模型中都是最重要的标志e。因此，MYC蛋白表达在原代骨髓MM细胞和从原代骨髓样本建立的MM衍生细胞系中，包括早期和晚期进展者f。这些结果表明，在BIcγ1模型中，内源性MYC表达在MM进展过程中获得，而MIcγ1小鼠中转基因MYC的早期激活加速了MM进展。同样，在患者中，MYC在MGUS细胞中的表达水平与BM PCs相似，而在MM细胞中表达水平升高，这与先前的研究一致，证实了MYC调节进展为MM的时间加快g。

小鼠MM细胞的遗传特征显示核型为三倍体、四倍体或复杂的非整倍体，并伴有反复的染色体获得和损失以及结构重排h-i。其中包括62例MM原代样品中的11例(18%)和6例MM衍生细胞系中的3例(50%)MYC与Igh或Igl基因之间的类似人类易位j。然后，作者评估了MYC在遗传多样性MM衍生细胞系中的致癌功能。用小分子MYCi975选择性靶向MYC诱导剂量依赖性MYC蛋白还原30,31，从而降低小鼠和人MM细胞的活力k。

3. MAPK-MYC轴指示多发性骨髓瘤的进展

通过全外显子组测序(WES)对肿瘤突变负荷(TMB)进行量化，62只小鼠中有29只（47%）在MM期观察到MAPK通路基因突变；这些比率与MM患者中观察到的相似，这表明该信号级联的突变在MM进展过程中积累a。早期和晚期MM细胞模型的基因组特征分析显示，MIcγ1小鼠的核型正常，没有MYC易位，而Trp53缺失的BIcγ1小鼠与未缺失Trp53的小鼠相比，染色体异常更丰富，TMB更高，表明TP53驱动的遗传不稳定性促进了MM进展过程中的遗传重排b。接下来，对比获得性MAPK突变在小鼠和人类MM中是否类似。western blot分析发现，在小鼠和人mm来源的细胞系中，蛋白激酶ERK (MAPK激活的替代物)的磷酸化一致c。曲美替尼(MEK-ERK inhibitor),逆转ERK磷酸化，降低小鼠和人MM细胞的生长，这表明共享MAPK激活d-e。鉴于在小鼠MM发育过程中获得了MAPK通路突变和MYC激活，研究MAPK信号是否可以调节MYC的表达是必要的。发现尽管曲美替尼在RNA水平上并没有持续改变MYC基因的表达，但MEK抑制降低了MYC Ser62位点的磷酸化，从而诱导了剂量依赖性MYC降解f。

4. 多发性骨髓瘤进展的免疫特征

为了从模型中获得进一步的见解，通过多参数流式细胞术测定了不同基因型小鼠在顺序疾病阶段的BM免疫微环境的顺序变化。在进展过程中观察到T淋巴细胞和NK数量的线性增加，这与PC扩增相关a-b。由于在不同小鼠品系的BM微环境中观察到广泛的T细胞和NK细胞浸润，我们根据T细胞和NK细胞的丰度对MM病例进行了划分（low，high）c。42%MM病例表现出与健康小鼠骨髓微环境相似的免疫细胞浸润，58%病例表现出更丰富的淋巴样细胞，主要是表型耗竭的CD8+ T淋巴细胞d。此外，浸润high组病例含有更多的免疫抑制性CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞，CD8+ T淋巴细胞的负荷与Treg细胞的数量相关，这表明T细胞的细胞毒性和免疫抑制状态在小鼠MM发育过程中相互作用d。

为了探索与人类疾病的相似之处，对病人相关样本进行了相同的检测，结果与小鼠模型一致e-h。接下来，作者研究了这些类别是否与小鼠和患者的MM生物学和临床特征相关。免疫浸润细胞数量较多的病例血清中单克隆免疫球蛋白水平较高，作为MM细胞负荷增加的替代指标i。此外，骨髓免疫表型与年龄相关，骨髓浸润T、NK淋巴细胞的数量与年龄呈负相关j。然而，在小鼠模型和人类中，肿瘤反应性淋巴细胞浸润的分布在MM遗传亚群中是相似的，包括标准风险和高风险类别k。

5. 多发性骨髓瘤MM的免疫治疗响应

为了检测小鼠模型的早期和晚期MM进展是否会影响对免疫治疗的反应，特别是对免疫检查点阻断(ICB)治疗的反应，对MIcγ1小鼠进行抗pd -1治疗，从MGUS期开始，持续8周，发现显著降了低肿瘤负荷，延迟了MM的发展a。相反BIcγ1小鼠在治疗中没有引起反应b。抗TIGIT单克隆抗体的类似治疗策略在两种小鼠模型中均未产生治疗效果a-b。研究了前驱期BM微环境的组成是否会对免疫检查点治疗产生调节反应。MIcγ1小鼠表现出更高的活化PD-1+、TIGIT+和LAG3+ CD8+ T淋巴细胞数量较BIcγ1小鼠，但免疫抑制CD4+PD-1+ Treg细胞数量也较低c-d。CD8+ T细胞与Treg细胞的比例在MIcγ1小鼠中较高e。为了探讨患者体内细胞毒性T细胞和免疫抑制T细胞之间的平衡，我们对69例未接受治疗的SMM患者的BM进行了流式细胞术分析。发现CD8+ T/Treg比值高的与比值低的患者相比，进展为活动性MM的时间更短(PFS: median progression-free survival) f-g，表明SMM的快速进展是通过肿瘤细胞阻断PD-1+CD8+ T淋巴细胞而发生的，而与Treg细胞无关，这表明具有高风险进展的SMM患者可能受益于抗PD-1治疗。接下来，在新诊断的170例临床活动性MM患者中研究BM CD8+ T/Treg比值，14%表现出更高T细胞比率与MIcγ1小鼠相似， 86%低比率患者与BIcγ1小鼠相似h，那度胺和地塞米松治疗后，发现比值高的患者早期复发率高i。这些发现表明，从前体阶段发展到MM的时间塑造了BM免疫微环境，这反过来影响了临床免疫治疗的结果。

6. 调节CD8+T/Treg比值提高免疫治疗效果

为了探索TME中T细胞亚群之间的功能相互作用，对小鼠和患者的MGUS期、MM期、健康对照 的BM CD3+ T淋巴cell进行了 scRNA-seq和TCR-seq a。在MIcγ1和BIcγ1小鼠中，CD8+ T细胞在MM期同样表达了耗竭/激活标记(Pdcd1、Tigit、Lag3)和细胞毒性标记(Ifng、Gzma、Gzmb、Gzmk)，但在MGUS期中几乎检测不到这些标记，Treg细胞也表达激活、免疫抑制状态的标记物，包括Tigit、Ctl4、Cxcr3、Tnfrsf9（编码Cd137）、Icos和Tnfrsf4（OX40）b。有趣的是，这种Treg细胞活化的表型在MGUS样品中已经很明显，并且在两种模型小鼠的MM阶段保持不变c。scRNA-seq和TCR-seq数据表明，在小鼠模型和患者MGUS期，CD8+ T细胞中发现了频繁的克隆型TCR序列（紫色与黄色重叠），但Treg没有d。

接下来，探讨破坏T细胞毒性和免疫抑制之间的平衡是否会影响对ICB的反应。发现CD8+ T细胞的耗竭明显加速MM的发病，而体内Treg细胞的耗竭则相反，提示CD8+ T细胞和Treg细胞在MM细胞的调控中起作用e-f。通过TIGIT抑制缓解CD8+ T细胞衰竭导致对PD-1和PD-L1阻断的反应，实现持久的MM反应g。此外，用CD25单克隆抗体消耗Treg细胞延长了小鼠的生存期，并增强了抗PD-1和抗PD-L1治疗的疗效h。总的来说，这些数据强化了骨髓CD8+ T/Treg细胞比例预测ICB反应性的概念，并为优化临床MM免疫治疗提供了潜在的生物标志物。

本文研究意义：

建立了多发性骨髓瘤的异质性模型，为疾病的治疗研究提供便利

提出了CD8+ T/Treg比值，作为检测及评估治疗的生物标志物

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