小G蛋白研究工具

小G蛋白，是具有GTP酶活性的一类蛋白，因其分子量只有20—30KD而得名。第一个被发现的小G蛋白是Ras，它是Ras基因的产物。根据序列的同源性，小G蛋白被分成若干亚家族，例如Rho，Ras，Ran，Rab，Arf和Rad / Rem / Gem / Kir。

小G蛋白家族成员在细胞信号通路中具有分子开关的功能，并参与调控许多生物学过程。下面小优就带大家一起来看看小G蛋白具体的功能以及研究方法吧～

Part1 小G蛋白的功能

1、Rho 亚家族

Rho 亚家族由 20 多个成员组成，目前研究得最多的是 Rac1、RhoA 和 Cdc42 蛋白。 Rho 蛋白主要通过一系列效应蛋白传递细胞信号，从而参与了广泛的细胞反应，包括细胞骨架重组1-2、转录调控3、细胞迁移4、细胞转化和转移5。

Rac1是一种分子量为21kDa的GTPase，由192个氨基酸编码组成。Rac1在多种细胞活动中起分子开关作用，包括细胞运动、发育、信号转导、细胞骨架组织、免疫反应、细胞周期、细胞间粘附、上皮分化，以及控制GLUT4转运以摄取葡萄糖。

RhoA 蛋白由 193 个氨基酸组成，分子量约为 22 kDa ，在调节肌动蛋白细胞骨架的动态组织（如聚合、肌动蛋白收缩性、应力纤维形成）以及调控依赖于动态肌动蛋白细胞骨架的细胞功能发挥着重要作用。此外，RhoA 还参与微管动力学的调控过程。

Cdc42是一个21.3 kDa的小GTPase蛋白，由191个氨基酸编码。Cdc42在多种依赖于肌动蛋白细胞骨架的细胞过程中发挥重要作用，如胞质分裂、吞噬、细胞迁移、形态发生、趋化、轴突引导、轴突成髓鞘、细胞内运输、基因转录、细胞周期调控和细胞命运决定等。

2、Ras 亚家族

Ras亚家族大约有 10 个成员，分为 Ras、Ral 和 Rap 蛋白。Ras 蛋白在控制增殖和分化的 Raf/ERK 信号通路中发挥作用；Ral 蛋白在内吞作用的早期阶段发挥作用； Rap 蛋白则是 Ras 蛋白的拮抗剂，它们位于晚期核内体和早期溶酶体区。

K-Ras 是三种 Ras 致癌异构体之一（其他两种为 N-Ras 和 H-Ras），由 189 或 188 个氨基酸组成，分子量为 21 kDa。与其他小G蛋白一样，K-Ras在非活性（GDP 结合）和活性（GTP 结合）状态之间循环，是许多不同信号级联和细胞过程的分子开关。K-Ras 参与不同类型的配体介导的信号转导途径，通过向细胞质和核仁传递有丝分裂和生长信号，影响细胞的增殖、分化、转化和凋亡。

3、Ran 亚家族

Ran 蛋白调节大分子的核运输，并在从 DNA 复制到进入有丝分裂的细胞周期检查点中起作用。

4、Rab 亚家族

作为最大的小 G 蛋白亚家族之一，Rab 蛋白调节着囊泡从 ER 到高尔基体再到质膜的流动过程，它们普遍表达，并且含量高。

5、Arf 亚家族

Arf 家族由 Arf 蛋白和类 Arf 蛋白（Arl's）组成6，它是小 G 蛋白家族中分歧最大的，与异源三聚体 G 蛋白家族有相同的亲缘关系。Arf 蛋白在核膜融合、高尔基体囊泡转运负调控和质膜内陷过程中起到协助作用。

6、Rad/Rem/Gem/Kir 亚家族

RGK 亚家族的成员具有广泛的功能，如控制心肌肥大、抑制肌细胞和脂肪细胞系中胰岛素刺激的葡萄糖的摄取，以及通过与 b-亚基结合抑制电压依赖性钙通道7。

Part2 小G蛋白的研究工具

针对小G蛋白的研究有多种方式，如测量活化的“GTP结合"形式、测量小G蛋白的总蛋白水平、 测定GTP和GDP之间互相转换的活性（Guanine exchange factors，GEFs，鸟嘌呤核苷酸交换因子）、测定内源性GTP酶速率，下面小优就为大家分别介绍这几种测量方法以及相关的研究工具。

1、小G蛋白的 GTP 结合活性测定

小G蛋白的活性测定有两种方法：pull-down和G-LISA。以Rho蛋白的活性测定为例，pull-down法就是将 Rho 效应子的 Rho-GTP 结合域 (RBD) 与琼脂糖珠耦合，以亲和力为基础检测生物样本中的活性 Rho8。这种方法有几个缺点，如耗时长、需要大量细胞的总蛋白、可同时处理的样本数量有限以及只能得出半定量结果。Cytoskeleton 推出的 G-LISA 技术将这一概念的准确性和灵敏度提升到了一个新的水平，该技术使用 96 孔格式和少量细胞/蛋白质，可提供高度准确的结果。

表：Pull down试剂盒 & G-LISA™试剂盒的对比

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2、小 G 蛋白总含量测定

小 G 蛋白的总水平曾一度被认为是细胞信号传导中无关紧要的旁观者，但科学家经过后续的研究，已经证实其是影响正常和患病细胞功能的真正因素。使用 WB或ELISA可以测量细胞或组织提取物中的小 G 蛋白总含量。

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3、GEF活性测定

GEF（Guanine exchange factors，鸟嘌呤核苷酸交换因子） 催化 GDP 与 GTP 的交换，使小 GTP 酶在细胞外信号的作用下产生活性。为了促进交换，GEF 必须与GDP - GTP 酶结合，从而破坏 GDP-GTP 酶复合物的稳定性，然后稳定无核苷酸的反应中间体。由于细胞内 GTP 与 GDP 的比例很高，释放出的 GDP 会被 GTP 取代，从而导致 GEF 从复合物中释放出来并激活 GTP 酶。许多 GEF 蛋白已被确认为致癌基因，并与癌症等人类疾病有关。然而，由于GEF 蛋白的表达具有组织或细胞类型特异性，因此研究小G蛋白能为癌症治疗提供新的研究方向。

最近开发的鸟嘌呤核苷酸荧光类似物大大提高了确定 GEFs 实时交换反应的能力，包括动力学和热力学性质，从而无需使用传统的放射性标记方法。这种基于荧光的检测方法利用了鸟嘌呤核苷酸的结合和非结合荧光类似物之间的光谱差异，因此能够监测小 GTP 酶的状态。广泛使用的荧光类似物之一是mant荧光团，它在360nm处被激发，在440nm处发出荧光。一旦与 GTPases 结合，mant荧光团的发射强度会急剧增加约 2 倍，因此，小 GTP 酶和 GEF 存在时荧光强度的增强将反映出已知或未知蛋白质各自的 GEF 活性。

下图展示了一种基于Mant荧光团的GEF检测方法，适用于96孔和384孔。该测定可应用于多种研究，例如以高通量筛选的形式表征GEF和GEF抑制剂。使用RhoGEF Exchange Assay试剂盒（BK100）来测定GEF活性，该试剂盒中含有人Cdc42, Rac1和RhoA蛋白和Dbs的GEF结构域，作为Cdc42和RhoA的阳性对照GEF（图1），Dbs显示Rac1的GEF活性极低（图2）。有趣的是，在基于FRET的实验中，人类Dbs可以激活Rac1。

图1. Cdc42, RhoA和 Rac1的GEF活性

图2. 96 孔板中 Cdc42、RhoA 和 Rac1 的 Dbs 交换活性。所示数据为三次实验的平均值。

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4、内源性 GTPase 速率测定

GTP与GDP结合状态的平衡，是它们从激活状态(GTP形式)转向非活动状态(GDP形式)时的转换机制的基础。GTP 与 GDP 结合状态的平衡由催化蛋白控制的，这些催化蛋白可以增加 GDP 与 GTP 的交换速率（GEFs），提高 GTP 酶的活性（GAPs），或阻止 GDP 的交换（GDIs）。最近的研究表明，GAP 蛋白家族有 70 个成员，规模庞大，在细胞从正常状态转变为疾病状态时发挥着重要的作用9。

细胞中的 GAP 活性可通过缺失或突变而降低，在这种情况下，GAP 所作用的小 GTP 酶处于活性 GTP 状态的时间延长，实际上就形成了一种永jiu活性状态。例如，Rho GTPase 控制着轴突导向的能力，一旦发生 Rho-GAP 的突变就会导致智力迟钝；突变的 Ras-GAP（NF1 基因）已被证明可导致神经纤维瘤病10；而突变的 Rheb-GAP 已被证明可导致结节性硬化综合症11。

目前已知的某些 GAP 具有 GAP 活性，其中大多数GAP 蛋白只是通过同源性才被认为含有 GAP 活性。Cytoskeleton推出了 GAP 活性检测试剂盒，为这一领域的探索提供了便利。试剂盒中的试剂经过优化，可使 GAP 蛋白具有高活性，这样就可以通过简单的吸光度检测方法来检测小 G 蛋白增强的 GTPase。

图3. 通过 RhoA 和 Rac1 蛋白水解 GTP 测定 p50 RhoGAP 活性

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参考文献：

1.Ridley, AJ. & Hall, A. The small GTP-binding protein rho regulates the assembly of focal adhesions and actin stress fibers in response to growth factors. Cell 70: 389-399 (1992)

2.Ridley, AJ. et al. The small GTP-binding protein Rac regulates growth factor-induced membrane ruffling. Cell 70: 401-410 (1992)

3.Coso, OA., et al.  The small GTP-binding proteins Rac and Cdc42 regulate the activity of the JNK/SAPK signaling pathway.  Cell 81: 1137-1146 (1995)

4.Small, JV., et al. The lamellipodium: where motility begins.  Trends Cell Biol. 12: 112-120 (2002)

5.Jaffe, A, & Hall, A,  Rho GTPases in transformation and metastasis, Adv. Cancer Res. 84: 57-80 (2002)

6.Clark et al. 1993. Selective amplification of novel members of the ADF-ribosylation factor (Arf) family: cloning of new human and Drosophila ARL genes. PNAS, 90, 8952-6.

7.Chang L. et al. 2007. Rad GTPase Deficiency Leads to Cardiac Hypertrophy. Molecular Cardiology, 116: 2976-2983.

8.Herrmann, C., Martin, G.A. and Wittinghofer, J. Biol. Chem. 270: 2901 (1995)

9.Bernards A. and Settleman J. 2004. GAP control: regulating the regulators of small GTPases. Trends Cell Biol. 14, (7), 377-385.

10.Cichowski K. and Jacks T. 2001. NF1 tumor suppressor gene function: narrowing the GAP. Cell. 104, 593-604.

11.Li Y. et al. 2004. TSC2: filling the GAP in the mTOR signaling pathway. Trends Biochem. Sci. 29, 32-38.