免疫细胞培养通关技巧之质量优化

免疫细胞培养的六个基本流程：样本制备、细胞分选、分型鉴定、扩增&培养、质量优化、后续研究。今天我们继续一起学习质量优化的相关知识。

质量优化（Quality Optimization）：针对一些不良因素，如样本制备成单细胞悬液时产生的细胞团块、碎片等；细胞扩增培养时支原体和内毒素的影响，并积极采取对应的措施。

1.单细胞悬液质量优化：这部分的内容大家可以参考《工欲善其事，必先利其器---单细胞悬液质量优化》进行学习。

2.细胞培养质量优化：在细胞培养过程，我们需要不定期进行支原体和内毒素的检测，如果不慎“中招"，可以做到及时止损。

支原体 (Mycoplasma) 是介于细菌和病毒之间，没有细胞壁的原核细胞型微生物。

（1）形态特征

支原体的体积很小，0.1-0.3 μm，光学显微镜无法观测，也无法通过0.22μm的过滤器过滤，并且传统的抗生素对支原体一般没有效果。支原体可寄生/共生/独立存活于培养基中，98%吸附于细胞膜或者细胞间隙。

（2）污染源

①支原体阳性细胞的交叉污染，并且由于支原体可垂直传染，一旦细胞发生污染，下一代细胞同样也会存在支原体的污染；

②实验操作人员的口腔、唾液等等，实验人员的操作习惯，如交叉使用培养液、防护不到位也会成为支原体的污染来源；

③培养条件如操作环境、培养用的仪器耗材清洁或灭菌不到位也都会增加支原体污染的风险。

（3）对细胞研究的影响

①抑制细胞生长、代谢，引起死亡：一般情况下轻度的支原体污染对于细胞的生长没有明显的影响，但是由于消耗培养液中的营养，所以细胞的生长会变慢，支原体也可能通过感染细胞并利用其生物合成机制，抑制关键代谢途径，最终导致细胞生长受阻和死亡[1]；

②染色体畸变，破坏核酸合成，DNA片段化：支原体可能通过与细胞核酸相互作用，引发染色体结构的变异，影响DNA合成和维持染色体完整性，如支原体感染可以模拟shRNA介导的p53敲除，允许Ras转化，从而使p53的功能失活[2]；

③改变细胞膜抗原性：支原体影响参与炎症和细胞转化的细胞途径，如支原体的蛋白质与TLR相互作用或进入细胞，从而改变负责炎症和DNA修复的几种途径[3]；

④改变转染效率：支原体可能通过影响细胞内的基因转运和表达机制，减缓或干扰DNA的转染效率[4]；

⑤对细胞凋亡诱导剂敏感性增加：支原体可以通过某些蛋白，调节细胞凋亡途径中的关键分子，增加细胞对凋亡诱导剂的敏感性，如NAE和支原体酶MGA-0676的相互作用，诱导的DF-1细胞凋亡[5]。

（4）支原体的预防：

支原体的污染防治也是很重要的，比如：日常1-2周进行支原体的检测，对于新到的细胞株、冻存保种前、重要实验开始前都应当进行支原体的检测。10个预防支原体的tips大家可以保存学习噢（图1）。

图1 预防支原体污染的10个技巧

表1 预防支原体污染的试剂

（5）支原体的检测方法：支原体的检测方法也非常多，小优也给大家整理了每种方法的原理、优缺点（表2）。

表2 支原体检测方法的比较

表3 支原体检测试剂盒

（6）支原体的去除：目前有效的支原体的清除方法是使用支原体清除剂，其他的方法比如清洗纯化法（利用离心力、细胞、微生物质量和悬液的浮力差达到清除支原体的目的）或者使用支原体特异血清也可以尝试。

表4 支原体去除试剂

内毒素（endotoxin）是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，其化学本质是一种脂多糖（LPS），其单位为Eu/mg或Eu/U。一个EU相当于约0.1至0.2 ng内毒素/mL溶液。内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏后才释放出来。

（1）特征：

内毒素非常耐热，只有在160℃，加热2-4h，或者用强碱/强酸/强氧化剂加热煮沸30min才能破坏其生物活性。

（2）污染源：

①配制各种试剂、缓冲液的水

②各种培养基、血清和添加剂中“混入"

③塑料器具、玻璃器具等表面

（3）对细胞的影响：

①细胞功能改变：内毒素可以刺激一些细胞分泌炎症因子，导致局部炎症反应，如低至 0.5 ng/mL 的内毒素处理6h就可以增加马腹膜巨噬细胞中IL-6的分泌[6]；

②导致细胞亚健康： 内毒素会加速细胞衰老、凋亡，甚至死亡；

③活化细胞：在单核细胞存在的条件下，100 ng/mL内毒素可以刺激人类T细胞的增殖及其淋巴因子的产生[7]；

④降低真核细胞系的转染效率：已纯化质粒 DNA 中的内毒素可降低所有细胞系的转染效率和活力，内毒素含量（> 10 EU/μg）会对标准细胞系中的转染、蛋白质表达和活力产生负面影响[8]。

（4）内毒素的预防：

①选择高质量/低内毒素的培养基、血清和试剂耗材，在免疫细胞的培养过程中，可以选择免疫细胞专用的无血清培养基，如果选择经典的培养体系，要选择低内毒素的血清和基础培养基；同时，免疫细胞培养的过程中添加的生长因子等也要选择高质量低内毒素的；

②重复使用的实验耗材可高温高压处理：250℃，30分钟，或者180℃，3小时；

③细胞培养的水质也至关重要，赛多利斯的mini纯水仪可以满足实验室每日15ml纯水/超纯水的用量，关爱每一个细胞宝宝；

④另外可以对培养过程中自行配置的一些缓冲液进行过滤除菌，这样可以在加入到细胞之前消除潜在的内毒素。

表5预防内毒素的相关产品

（5）内毒素的检测：

小优也给大家整理了内毒素每种检测方法的原理、优缺点（表6）。常用的方法是鲎试剂法和重组 C因子法，由于鲎作为国家二级保护动物，目前不能再进行大规模使用。所以我们推荐大家使用重组 C因子(rFC) 法来检测内毒素。

表6 内毒素的检测方法

表7 内毒素的检测试剂盒

（6）内毒素的清除：

细胞培养中的内毒素暂时没有方法可以有效去除，所以小优建议大家做好预防，毕竟防大于治！

参考文献：

1 Netto, Cristiane et al. [publication of the Brazilian Society for Microbiology] vol. 45,4 1513-9. 4 Mar. 2015

2.Logunov, D Y et al Oncogene vol. 27,33 (2008): 4521-31.

3.Benedetti, Francesca et al. “Mycoplasmas-Host Interaction: Mechanisms of Inflammation and Association with Cellular Transformation." Microorganisms vol. 8,9 1351. 4 Sep. 2020

4.Yin, Zi-Fei et al. “Mycoplasma contamination-mediated attenuation of plasmid DNA transfection efficiency is augmented via L-arginine deprivation in HEK-293 cells." Journal of Zhejiang University. Science. B vol. 20,12 (2019): 1021-1026

5.Li, Peng et al. “Mechanism of Apoptosis Induction by Mycoplasmal Nuclease MGA-0676 in Chicken Embryo Fibroblasts." Frontiers in cellular and infection microbiology vol. 8 105. 4 Apr. 2018

6.Morris,D.D., Crowe, N., Moore, J.N.and Moldawer, L.L. Endotoxin-Induced Production ofInterleukin 6 by Equine Peritoneal Macrophages In Vitro. Am. J. Vet. Res.53:1298-1301 (1992

7.Mattern, T.,Thanhauser, A., Reiling, N.,Toellner, K., Duchrow, M., Kusumoto, S.,Rietschel,E.T., Ernst, M., Brade, H.,Flad, H.D. and Ulmer, A.J. Endotoxin and Lipid A StimulateProliferation of Human T Cells In the Presence of Autologous Monocytes. J.Immunol. 153:2996-3004(1994)

8.Butash, KA et al.(2000) Reexamination of the Effect of Endotoxin on Cell Proliferation and Transfection Efficiency.Biotechniques 29(3): 610-614, 616, 618-619