工欲善其事，必先利其器---单细胞悬液质量优化

随着流式分析、细胞分选、单细胞组学、质谱流式等研究技术的蓬勃发展，单细胞也在肿瘤免疫学和神经生物学等多个领域成为大众的焦点，它能够很好地反映细胞的特异性和异质性。目前，组织（以肿瘤组织为例）制备成单细胞悬液的方法主要有机械解离法、酶解法和化学法（图1）。

图1 肿瘤组织制备成单细胞悬液的方法[1]

高质量的初始样本是实验成功的关键。然而如何在此基础上，进一步优化粗悬液，获得高质量的单细胞悬液呢？基于三者的原理以及适用范围等（表1），我们发现这些方法处理样本时，没有统一的标准。就机械法来说，每次实验研磨的力道稍有不同，对细胞造成的损伤也不一样，这样就很难保证实验的重复性。不仅如此，处理样本的过程中，细胞可能会出现“死亡、碎片化、粘连"的情况，甚至某些组织如脾脏、心脏等还存在“红细胞"这一干扰因素。

表1 组织制备单细胞悬液方法的区别

针对这些问题，我们“对症下药"，单细胞悬液质量优化的神兵利器主要有以下五种：

1、gentleMACS Dissociator：gentleMACS全自动组织温和处理器可快速、温和、安全、自动、便捷和标准化地将组织（如脾脏、肝脏、肿瘤、表皮等）处理成单细胞悬液，可谓是组织样本处理的绝好帮手。其包含全自动组织解离器、zhuan利解离管和针对不同组织优化的解离试剂盒，以及预设软件程序在内的整体方案，实现对不同组织样本的优化解离，确保细胞的活力、功能和表面表位的完好。能够确保每一次解离都在优化条件，同时解放双手，结果也可以轻松重复。

2、预分离：粗悬液中的细胞团块会导致细胞的不wan全标记或增加非特异性结合标记而分离得到许多非目的细胞。不仅如此，在一些后续的细胞培养过程中，细胞团块也会影响细胞的最佳状态，影响实验结果。因此，我们可以在粗悬液制备后对其进行预分离，利用细胞滤器或筛网等，去除粗悬液中的细胞团块。

3、死细胞去除：在二代测序，细胞分选等下游实验中，死细胞将影响结果的准确性和有效性。死亡的细胞易裂解导致其中的RNA释放出来，会导致检测的背景噪声，进而影响单细胞数据的质量。此外，在细胞分选中，死细胞会影响捕获细胞计数的准确性，不利于下游的细胞培养和功能验证等实验。需要注意的是，当细胞活率<30%时，不建议进行此项操作，去除死细胞后，细胞活率虽然达到90%以上，但大部分细胞都已经死亡，细胞类型及分群会改变。

图2 经热休克处理的外周血单核细胞（PBMC）死细胞去除前后细胞分群比较[2]

4、去除碎片：机械解离的研磨，酶解法的吹打，甚至是离心过程，都可能会产生细胞碎片。样本制备过程中产生的细胞团、细胞碎片等会增加微流体芯片的堵塞风险，也会增加流式等实验中细胞的非特异性标记。我们可以通过严格控制上述操作的精度和力度来减少细胞碎片（难度较大），也可以使用细胞碎片去除试剂盒来优化（方便快捷）。

图3 成年大鼠心脏组织单细胞悬液去除碎片前后细胞群比较[2]

5、红细胞裂解：诸如脾脏、心脏、肝脏等制备单细胞悬液都会涉及到红细胞的裂解。红细胞过多会导致有效细胞识别不准确、有效细胞-非细胞界限模糊、有核率低等问题。

图4 成年大鼠心脏组织单细胞悬液（已去除碎片）进行红细胞裂解前后比较[2]

相信有了这些法宝，小伙伴们一定能够获得高质量单细胞悬液（表2），顺利开展实验啦!

表2 高质量单细胞悬液质控标准

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资料来源：

[1] Mitra A, Mishra L, Li S. Technologies for deriving primary tumor cells for use in personalized cancer therapy. Trends Biotechnol. 2013 Jun;31(6):347-54.

[2]美天旎