DELFIA® EuTDA法检测细胞杀伤功能

本文阐述了DELFIA® EuTDA法在不同场景中，如：CAR-T、CAR-NK和抗体依赖的细胞毒性（ADCC）检测细胞杀伤功能的应用。该方法灵敏度高，特异性好，适用范围广等优势，得到广泛的认可。

技术原理介绍
靶细胞与BATDA共孵育，BATDA进入细胞后，被内酯酶裂解形成TDA，亲水性的TDA不能再穿过细胞膜屏障。与效应细胞共孵育，启动杀伤效应将靶细胞中的TDA释放到上清液中，然后将其转移到检测板上，并化合物溶液结合生成荧光分子EuTDA。细胞裂解导致EuTDA的增加，因此信号的增加与标记的靶细胞群的细胞死亡相关。

注：下文中BATDA法亦指DELFIA®EuTDA法。

CAR-T杀伤功能评价
嵌合抗原受体(CAR)T细胞治疗是适应性免疫治疗的前沿。CAR-T细胞是由T细胞设计而来的，通过促进癌细胞表面的相互作用来特异性地靶向肿瘤细胞。CAR-T细胞的激活导致了由CAR-T细胞产生的细胞因子和趋化因子产生的细胞信号通路的增加，以帮助破坏靶向肿瘤细胞。

Zhicai Lin等人在《Evaluation of Nonviral piggyBac and lentiviral Vector in Functions of CD19 chimeric Antigen Receptor T Cells and Their Antitumor Activity for CD19+ Tumor Cells》一文中使用BATDA法评价病毒转座子（piggyBac）和慢病毒载体（LV）转染对CAR-T细胞杀伤的功能分析。1×105Raji细胞在37°C下用BATDA标记30 min，后用PBS洗涤三次以去除多余的BATDA。CD19pb CAR-T细胞和CD19lv CAR-T细胞添加到BATDA标记Raji细胞96孔V底板，效靶（E:T）比16：1，8：1，4：1，2：1和1：1，37°C，5%CO2条件下孵育4小时。取上清，加入Eu solusion，选择酶标仪TRF读板。

与Mock T细胞相比，CD19pbCAR-T细胞和CD19lvCAR-T细胞均具有较高的细胞毒性。虽然CD19pbCAR-T细胞在E：T为4：1和16：1时杀死CD19+WTRaji细胞，但CD19pbCAR-T细胞在任何E：T下对CD19KORaji细胞没有细胞毒性。CD19pbCAR-T细胞用于靶向CD19的ScFv具有特异性和有效性。

CAR NK杀伤功能评价
CAR-T细胞是常用的效应细胞类型，然而使用CAR-T细胞进行治疗可能与危及生命的毒性作用有关，如细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性。此外，肿瘤细胞可能发展出免疫逃逸策略，如抗原丢失，阻止CAR-T细胞识别。相比之下，CAR转导的NK细胞是具有更多短暂毒性的短寿命细胞。此外，NK细胞的细胞毒性可以通过刺激和抑制受体以CAR独立的方式，增加抗肿瘤活性。

Alejandra Leivas等人在《NKG2D-CAR-transduced natural killer cells effificiently target multiple myeloma》一文中采用BATDA法进行体外杀伤功能检测。NKAE和T细胞产物对MM细胞的EuTDA释放试验评估细胞毒性。以U-266、L-363、OPM-2骨髓瘤细胞和原代多发性骨髓瘤（MM）细胞作为靶细胞，与效应细胞按定的靶细胞（E：T)比例孵育4小时。为了检测CAR转导的效应细胞的安全性，我们以供体PBMC、CCD-18Co和NL-20细胞系为靶点，进行了细胞毒性试验。

NKAE细胞对U-266MM细胞系表现出强大的细胞毒性活性，在最大E：T比值（32：1）时，破坏了77.7%的MM细胞。与NKAE细胞相比，CAR-NKAE细胞表现出更好的细胞毒性，在E：T为8：1已破坏*的MM细胞。与CAR T相比，CAR-NKAE对MM细胞系表现出更强的细胞毒性。

抗体依赖的细胞毒性ADCC
在防御入侵病原体的过程中，免疫球蛋白由B细胞形成的。它们通过其Fab结构域与病原体结合，随后通过免疫球蛋白Fc受体激活补体和免疫细胞。最大的部分是免疫球蛋白γ（IgG）抗体，它通过髓系和自然杀伤（NK）细胞上的Fcγ受体（FcγR）介导其效应功能。抗体依赖性细胞毒性（ADCC）是IgG的主要Fc依赖的效应功能之一，在清除病毒感染中尤为重要，主要由NK细胞介导。

Steven W等人在《FcγR Binding and ADCC Activity of Human IgG Allotypes》研究中分别对抗CD20，抗CD52，抗RhD和抗TNP抗体ADCC进行了评价。IgG2和IgG4没有诱导NK细胞介导的ADCC活性，这与其与FcγRIIIa的结合很弱相一致。在IgG1能有效且类似地诱导ADCC（~70%杀伤），在IgG1之间没有观察到差异，在IgG3中，诱导ADCC的能力差异很大，从20%到80%，这仅与SPR测量的亲和力差异部分匹配。为了确定我们的发现是否具有抗原依赖性，我们还在一个以TNP化红细胞作为靶细胞的平行实验中分析了抗TNP IgG的ADCC能力。抗TNP ADCC数据与抗RhD抗体的ADCC数据非常相似。

DELFIA® EuTDA法综合评价
中检院曾发文题为《免疫细胞治疗制剂体外杀伤效力评价》，文中对51Cr 、BATDA 、CAM 、CytoTox-Glo 、PKH、EliSpot和LDH法进行了杀伤效果评价。其中51Cr同位素法是检测杀伤的金标准，结果总结，BATDA法与51Cr 释放法的平行性最好，作用时间明显缩短，可重复性高，对悬浮靶细胞和贴壁型靶细胞均具有很好的适用性。可重复性好，可以满足免疫细胞体外杀伤效力检测的需要。

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