活体转染应用第七弹之玻璃体注射

哈喽，最近发现很多小伙伴询问活体转染关于玻璃体注射的应用，今天小编就带着几篇相关应用文献来给大家简单介绍一下。

第一篇是来自中山大学中山眼科中心余克明教授与庄菁研究员团队发表在Cell Death and Disease杂志上，题为"Lithium promotes DNA stability and survival of ischemic retinal neurocytes by upregulating DNA ligase IV"。

本文中，作者直接在缺血性大鼠视网膜中直接测试了锂对DNA NHEJ（非同源末端连接）活性的影响。I/R（缺血再灌注） 手术后，如材料和方法中所述递送NEHJ底物即线性化 pEGFP-N1。转染后48 h，固定眼球，切片并检查GFP表达。正如预期，RGC层显示出最大的活性（图1c），并且在I / R手术中，锂显着促进了DNA NHEJ活性（*P<0.05;图1d）。有趣的是，即使没有 I/R 手术，锂也促进了 NHEJ，效率提高了 1.83 倍 （*P<0.05）。作者推测，观察到这种效应是因为转染对RGC层中的细胞造成轻度损伤。此外，在I/R手术组中，锂促进了DNA NHEJ活性的2.4倍（**P<0.001）。即使没有锂预处理，I/R 手术也显着增强了 NHEJ 事件 （**P<0.001）。 这些结果与先前的报道部分一致，即缺血刺激自发激活DNA修复，并且锂在病理性缺血状态下促进DNA修复

图 1. (C).体内DNA NHEJ测定。（NHEJ修复测定的策略如图3d所示。）I/R手术后24小时，按照制造商的说明，在转染试剂（in-vivo jetPEI）后，用线性化质粒pEGFP-N1进行玻璃体内注射。在转染后48小时，将视网膜固定并切片。在RGC层中可检测到GFP。比例尺：100μmm (D).大鼠视网膜中GFP阳性细胞的比较。锂预处理促进DNA NHEJ活性（假，0.67±0.62;假+锂， 1.25±0.72; I/R 手术，5.5±1.19;I/R 手术+锂，13.25±1.83）。n=8，每组，*P<0.05。**P<0.001。所有误差线均代表 SEM

方法

配置质粒/in vivo jetPEI 复合物：EcoR1切割质粒pEGFP-N1后通过添加超纯水调整浓度至4 μg/μl。根据生产商操作方法配置转染复合物：将所需量的质粒和转染试剂分别用10 μl 10%葡萄糖稀释。每 μg线性化质粒pEGFP-N1添加0.05 μl in -vivo jetPEI。将质粒和转染试剂混合并在室温下孵育15min后形成转染复合物即可注射。pcDNA3.1作为阴性对照。

玻璃体内注射：共32只重250-300g成年 Sprague–Dawley 大鼠用于玻璃体内注射。实验分为2组（每组16只大鼠）：实验组和对照组。实验组每天皮下注射氯化锂一次，从缺血前1周开始，到组织取样当天结束，而对照组仅接受相同量的PBS。每日氯化锂剂量1.0mEq/kg。每组分为两个亚组（每个亚组8只大鼠）：取一个亚组进行I/R实验，另个亚组不进行I/R作为对照。I/R手术后24小时，对所有大鼠的右眼进行玻璃体内注射。每次注射2.5 μl 转染复合物，使用Hamilton注射器在无菌条件下进行玻璃体内注射。

第二篇是最近发表在Communications Biology上题为“Vascular cell-adhesion molecule 1 (VCAM-1) regulates JunB-mediated IL-8/CXCL1 expression and pathological neovascularization"血管细胞粘附分子1（VCAM-1）调节 JunB 介导的 IL-8/CXCL1 表达和病理性新生血管形成

VCAM-1敲除小鼠由于胎盘发育缺陷导致胚胎致死，所以这里作者使用玻璃体内注射 VCAM-1 siRNA 来评估 VCAM-1 缺失对 OIR（氧诱导视网膜病变）诱导的小鼠病理性视网膜血管生成的重要性。我们在 P12 和 P14 时进行玻璃体内注射 0.5 μl 含有in- vivo jetPEI® 转染试剂和 1 μg 对照或 VCAM-1 siRNA 的 5% 葡萄糖溶液。在P15时，对眼睛进行眼球摘除，分离视网膜，并制备视网膜提取物，并分析常氧和缺氧视网膜中的CXCL1、JunB和VCAM-1水平。与对照 siRNA 组相比，注射 VCAM-1 siRNA 的小鼠缺氧诱导的 CXCL1、JunB 和 VCAM-1 表达减弱（图 2a）。在 P17 时，视网膜也用异凝集素 B4 染色，平放，并量化新生血管形成或缺血面积的百分比。VCAM-1水平减弱的缺氧诱导的视网膜新生血管形成（图2b和c）和视网膜内皮细胞（EC）尖duan细胞形成（图2e）的下调。在对照组或VCAM-1 siRNA组的缺血面积方面未观察到显著差异（图2d）。这些观察结果表明，VCAM-1 在 OIR 小鼠模型中调节 JunB-CXCL1 信号传导和病理性视网膜新生血管形成。

图2. 将 C57BL/6 小鼠幼崽暴露于 75% 氧气 （P7-P12） 中，返回室内空气中，并在玻璃体内注射 0.5 μl 的5% 葡萄糖溶液 包含in vivo jetPEI®的 和 1 μg 对照或 在P12 和 P14 的 VCAM-1 siRNA。在 P15 时，眼球摘除，分离视网膜，制备组织提取物并分析 ，通过蛋白质印迹法检测 CXCL1 和JunB水平，并在印迹中重新检测 VCAM-1 和 β-tubulin，用来显示 siRNA 对其靶标和脱靶分子的影响。b、d、e 一切都与图 （a） 相同，除了在 P17 时，眼睛被摘除，视网膜分离，用异凝集素 B4 染色，准备平坦支架并检查视网膜新生血管形成 （b）、缺血区 （d） 和内皮jian端细胞形成 （e）。面板 b 中的中间列显示所选区域的较高放大倍率。新生血管在图（b）的第三列中以红色突出显示。c、d 条形图表示新生血管形成 （c） 和缺血面积 （d） 的定量分析。n = 每组 8 只 （c， d） 每组为生物学独立的眼睛，用平均值表示± SD。 *P < 0.05 与 siControl。在面板 （b） 左列和右列中 比例尺代表500 μm，面板 （b） 中列代表20 μm，面板 （d）中代表 500 μm，面板 （e） 上行代表 20 μm，面板 （e） 下行代表 50 μm。

方法：

小鼠在12小时光照/12小时黑暗循环环境中饲养和繁殖，并随意喂食水和食物。在出生后第7天（P7），在BioSpherix室中将有母鼠的小鼠幼崽暴露于75%的氧气（高氧）5天（P7-P12），在P12时，幼鼠和母鼠一起返回室内空气。对于对照组，将同龄小鼠幼崽保持在21%氧气（即室内空气）下。在 P12 和 P14 时，in- vivo jetPEI和1ug siRNA混合在终浓度为5%葡萄糖溶液中形成转染复合物，使用35 G针对小鼠幼崽玻璃体注射剂量为0.5uL转染复合物。

相关文献

[1] Yang, Ying , et al. "Lithium promotes DNA stability and survival of ischemic retinal neurocytes by upregulating DNA ligase IV." Cell Death & Disease 7.11(2016):e2473.

[2] Kaur, Geetika , et al. "Vascular cell-adhesion molecule 1 (VCAM-1) regulates JunB-mediated IL-8/CXCL1 expression and pathological neovascularization." Communications Biology 6(2023).

订阅信息：