养细胞不做冤大头，3分钟帮你搞定支原体污染

细胞培养是每个实验者都会使用的技术，但是细胞在培养过程中常受到许多不同来源的污染，如细菌、真菌、支原体和内毒素污染等等，其中支原体污染最难发现和处理。综合FDA、ATCC等机构收集到的相关数据，世界各国细胞系支原体污染的平均比例为30-60%。它们不仅与宿主竞争营养，还会掩盖一些化合物毒性影响，因此细胞受到支原体污染后不但会抑制生长和新陈代谢、改变DNA转染效率，甚至最终会导致细胞死亡，严重影响实验结果的可靠性、重复性及一致性，所以在实验中定期做好支原体预防、检测和清除极为关键。

支原体污染细胞状态 图片来源网络

什么是支原体？

支原体模式图 图片引自David S. Goodsell手绘

支原体又称霉形体，是目前发现最微小、能够自我复制且不具有细胞壁的原核生物，直径大小仅为50-300nm，可通过滤菌器； 支原体可分为口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体、发酵支原体、人型支原体、唾液支原体、肺支原体和梨支原体等多种类型。

支原体污染对细胞的危害

●抑制细胞生长和新陈代谢；

●干扰核酸合成，染色体畸变；

●改变细胞膜抗原性，并可能改变DNA转染效率；

●增加了对凋亡诱导物的敏感性；

●细胞死亡。

图片引自Lonza

支原体污染来源

典型的支原体污染来源比较广泛，通常包括以下几种来源：

●未检测细胞之间交叉污染；

●实验室环境或实验器材的直接污染；

●培养基或其他试剂污染；

●实验人员无菌操作不当；

●制备细胞的组织或器官产生污染。

支原体污染的特性

一般细胞被支原体污染了几个月都没有被发现，支原体污染之所以很难检测和预防，是因为其具有非常高的隐蔽性，具体如下：

●体积非常小，即使在支原体高浓度（>107 cfu/ml）下，显微镜下也不可见；

●相对于细菌污染，支原体污染不会引起浑浊或PH值改变等可见变化；

●大部分用于细胞常规培养的抗生素对支原体无效；

●常规的过滤也无法去除支原体。

如何预防支原体污染？

如何进行安全的细胞培养并预防支原体的污染呢？优宁维为大家总结了十个技巧：

●穿戴适当的个人防护设备(手套、专用的干净实验服、护目镜)并消毒手套

●在细胞处理开始前以及处理不同细胞系之间擦拭安全柜中的工作桌面

●避免在你的细胞上说话或打喷嚏

●避免飞溅、溢出和气溶胶

●为每个细胞系使用zhi定的培养基瓶

●定期清洁培养箱，包括水盘

●定期清空及清洁水浴设备

●细胞复苏几天后测试新细胞培养物的支原体污染

●隔离所有进入实验室的细胞培养物,直到它们经过支原体检测

●不要忘记：每2周进行一次支原体的常规检测

如何检测和清除支原体污染？

一般来说，新的细胞株都需要做支原体检测，细胞培养期间，建议每1-2周进行一次支原体检测以防止污染。因此，在实验室的日常研究需求中，需要一种快速、全面的检测方法以应对日常的检测需求。

支原体检测——Lonza MycoAlert™支原体快检

1、检测原理

目前，在95%支原体污染来自6个种属，在这些种属和大多数的柔膜细菌中，存在两种酶，乙酸激酶和氨基甲酸激酶，MycoAlert™通过检测两种酶的活性，完成支原体检测。仅需两步简单操作，20分钟即可完成检测。这两种酶在真核细胞中不存在，因此，既可保证检测的准确性，又可快速完成检测。

2、检测方法

3、数据解读

4、产品优势

1.只需两步操作，20分钟内出结果；

2.生物发光技术，无需抽提DNA；

3.MycoAle­t™ PLUS试剂盒可用于低敏板式发光仪或多功能发光仪上；

4.可检测所有常规的支原体和甾原体的污染

5.可检测44种柔膜菌纲（支原体）物种

6.适用于研究中细胞培养环境的筛选

7.适用于检测新的培养基，水，添加物（如血清等）

支原体清除——Lonza MycoZap™支原体去除试剂

支原体无法通过无菌过滤去除。由于支原体没有细胞壁，常规的细胞培养抗生素（如青霉素）对它也不起作用。多数情况实验者丢弃已污染样品。但是有时实验者出于某些原因不能丢弃已污染的样品，就可以通过MycoZap™支原体去除试剂在4天内清除支原体。挽救他们的样品。

1、作用原理

它通过抗生素和抗代谢药剂的共同作用来终止支原体。这种方法高效可靠的去除支原体，解决单独的抗生素对支原体不起作用的问题。MycoZap™支原体试剂可清除细胞培养中的柔膜纲污染包括支原体、甾原体、螺原体、虫原体。

2、使用方法

1.在25cm2的培养瓶中添加4.5 ml培养基（胎牛血清<5%）；

2.在培养基中加入500µl的MycoZap™ reagent 1，轻轻旋转混合；

3.在培养基(含5% (v/v)胎牛血清)中制备细胞悬液，细胞密度为105个/ml；

4.向MycoZap™培养基混合液中加入5 ml细胞悬液；

5.根据细胞增殖速率，正常孵育2-6天；

6.在传代之前，取2ml细胞培养上清液，用MycoAlert™试剂盒进行检测；

7.将细胞正常传代至9.5ml新鲜培养基中；

8.向细胞中加入500µl的MycoZap™ reagent 2；

9.检测阴性后即可正常培养细胞。

3、产品优势

1.全面、彻di的支原体去除试剂

●消灭支原体、甾原体、螺原体、虫原体

●通过抗生素与抗代谢药剂的联合作用有效去除柔膜纲物种

2.有效而温和

●细胞毒性最小化

●广泛地适用于细胞培养

更多支原体检测指导、产品咨询请联系优宁维获取

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