人结直肠癌类器官培养攻略-原代培养

一、准备工作  
1.仪器设备
CO2 培养箱、双人单面超净台、倒置显微镜、台式冷冻离心机、水浴锅（abs72023）或水浴摇床，医用冰箱、-80℃冰箱、移液器（一套）、眼科剪、眼科镊。

2.试剂耗材
人结直肠癌类器官培养基试剂盒（abs9445），基质胶（低因子、无酚红）（abs9495），60mm细胞培养皿（abs7005）， 100μm滤筛（abs7009），15ml离心管（abs7102），1.5ml EP管若干（abs7119），24孔细胞培养板（abs7058）、金属冰盒、眼科剪刀、眼科镊。

人结直肠癌类器官培养基试剂盒（abs9445）

试剂盒组成

基质胶（低因子、无酚红）（abs9495）

二、操作流程
1.  类器官操作流程之——样本准备
（1）将组织放入含有预冷的（2-8°C）组织保存液 E的取样瓶中（浸没整个组织），4℃从医院/实验室取回。
（2）将取样瓶消毒，组织取出放入培养皿样本拍照，并登记，大小，颜色，软硬程度，组织类型等信息。

2.  类器官操作流程之——清洗-剪碎
在60mm细胞培养皿（abs7005）里用2-3ml原代培养缓冲液 B浸泡。用原代培养缓冲液 B清洗三次（每次更换培养皿）后剪碎，剪成大约1-3mm3的组织块，静置2次。

3.  类器官操作流程之——消化-过滤
（1）向EP管中加入适量人结直肠癌原代组织消化液 C（消化液是组织体积的3-5倍）在37℃进行消化10-15min（消化过程中随时观察消化情况）。
（2）取少量液体在显微镜下观察，镜下观察到较多的单个细胞或 70um 以下的细胞簇后， 加入3倍体积原代培养缓冲液 B 终止消化，用枪头轻柔吹打可以看到液体变浑浊。

（3）使用100μm滤筛（abs7009）进行过滤，取少量滤液在镜下进行观察。将滤液收集到15ml离心管，于300g 4℃ 富集离心5min后移去上清（清洗一次），添加1ml左右原代培养缓冲液 B 转移到1.5mlEP管，重新重悬离心（清洗二次）。

4.  类器官操作流程之—离心、加胶
基质胶计算：第3步后观察收集到的组织体积，添加25倍组织体积的基质胶（abs9495）重悬铺板（金属冰盒或冰上操作）。

5.  类器官操作流程之——点胶-加液
以24孔细胞培养板为例，每孔点胶25ul组织基质胶混合物进行铺板（（金属冰盒或冰上操作），将铺好的培养板放入37℃培养箱中10-15min成胶，添加500-750μl 人结直肠癌类器官培养基 A（恢复室温）进行培养。

6.  类器官操作流程之——观察

类器官原代培养D1                    类器官原代污染

传代培养
一、类器官传代培养之-样本收集
1. 移液器吸去培养基，每孔添加 1-2ml 左右4℃类器官传代培养缓冲液G放置 2min。
2．移液抢轻柔吹打基质胶，收集在 15ml 离心管中，4℃静置 10min(每 6-8 孔为一组) 。

二、  类器官传代培养之-样本消化
1.  类器官数量不足或体积较小时：300g 4℃ 离心 5min 弃去上清，添加1ml类器官传代培养缓冲液 G重悬移入 1.5ml 离心管，300g 4℃ 离心 5min（如图5）弃去液体进行第3步。
2.  类器官数量较多或体积较大时：300g 4℃ 离心 5min 弃去上清，添加适量类器官传代消化液 D（是类器官悬液的1-2倍）超净台内消化 2-3min（中间可以吹打1-2次）（如图6） ，添加适量类器官传代培养缓冲液 G（缓冲液G：传代消化液D=5:1）终止消化，300g 4℃ 离心 5min 弃去上清，添加1ml类器官传代培养缓冲液 G重悬移入 1.5ml（ 如图7） 离心管，300g 4℃ 离心 5min 弃去液体进行第3步。（如图4）

三、类器官传代培养之-铺板
类器官收集后，添加25倍基质胶重悬（基质胶体积：细胞沉淀体积=25:1），每孔25μl（如图8） 基质胶铺在 24孔细胞培养板中，放置培养箱中 10-15min 添加 500μl-750ul（如图9）人结直肠癌类器官培养基 A。

 
四、类器官传代后增殖现象

类器官冻存

1、移液器吸去培养基，每孔添加 1-2ml 左右4℃类器官传代培养缓冲液G放置 2min。
2、移液抢轻柔吹打基质胶，收集在 15ml 离心管中，4℃静置 10min(每 6-8 孔为一组) 。
3.  300g 4℃ 离心 5min 弃去上清，添加1ml类器官传代培养缓冲液 G重悬移入 1.5ml 离心管，300g 4℃ 离心 5min弃去液体。
4、添加适量类器官冻存液 F，轻柔吹打重悬，以24孔细胞培养板为例：密度为2个孔冻存 1管（500个/ml密度冻存），每管体积1.4ml。
5、冻存方法（1）：将冻存管放入梯度冻存盒然后保存至-80℃过夜，第二天取出放入液氮罐。
冻存方法（2）：4℃冰箱放置30 min，转移至-20℃放置1 h，最移至-80℃过夜，第二天取出放入液氮罐。

类器官复苏
 1、实验前准备
将水浴锅预热至37℃；
细胞实验室进行常规消毒，用预防喷雾喷涂并且使用紫外线照射40min的超净工作台台面；
在超净工作台中按次序摆好消过毒的离心管、吸管、培养板等。

培养箱除菌剂                                                                                     细胞房除菌剂

2、取出冻存管
根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
从液氮罐中取出冻存盒，取出所需的冻存管，同时核对冻存管外的编号。

冻存管（abs7163）

冻存管（abs72023）

3、迅速解冻
迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中解冻，并要不断地摇动，使管中地液体迅速融化。约1-2min后冻存管内液体全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管地外壁，再拿入超净台内。

4、将类器官组织液移入15ml离心管，添加类器官传代培养缓冲液 G 10ml重悬，轻柔吹打混匀，300g 4℃ 离心 5min。

5、弃上清，添加1ml 类器官传代培养缓冲液 G重悬将沉淀转移至1.5ml EP管，300g 4℃ 离心 5min，弃去上清。

6、添加25倍基质胶（abs9495）重悬（基质胶体积：细胞沉淀体积=25:1），每孔25μl基质胶铺在 24孔细胞培养板中，放置培养箱中 10-15min 添加 500μl-750ul 人结直肠癌类器官培养基 A。

类器官鉴定
一、类器官鉴定-类器官收集

1、类器官收集
2、清洗1-3遍，洗去大部分基质胶，离心弃去大部分上清

二、类器官鉴定-琼脂糖凹槽制备

三、类器官鉴定-固定

四、类器官鉴定-包埋

 
五、类器官鉴定-HE染色

 
六、类器官鉴定-HE染色结果（以肺癌为例） 

人肺癌类器官HE染色

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