Bionano平台技术拓展–ROM 全基因组甲基化分析

Bionano OGM是一种强大的光学图谱技术，它使用超长DNA分子从头构建整个基因组，并能够有效地检测基因组结构变异。同时它还能用于基因组功能分析，如表观遗传学、DNA复制图谱和动力学分析等。其原理是利用荧光标记基因组上特定序列，在纳米孔道中电泳拉直DNA后拍照获得荧光的分布，进而分析特定序列在基因组上的分布和状态。基于该原理，Bionano研发团队和科学界一起开发了多种荧光标记方法，并不断探索其在基因组研究中的应用方向。例如基于特殊甲基转移酶的DLS标记方案和基于基因组缺刻酶的NLRS标记方案。除此之外还有很多特殊的标记方法，其中不乏非常有前景的方向。2019年Bionano研发团队与科研工作者在Genome Research杂志上公布了一种基于荧光甲基化图谱的检测方案-ROM, 并测试了该方法在面肩肱型肌营养不良症 (FSHD)中的应用【1】。

DNA甲基化与研究方法

DNA甲基化在调节基因表达中发挥关键作用。基因启动子的甲基化状态可以预测基因活性，且研究发现发育过程中和疾病中的DNA甲基化与基因表达和蛋白质丰度相关。目前DNA甲基化的主要研究方法是NGS甲基化测序，即利用不同手段将甲基化和非甲基化的碱基区分并分别测序。但是甲基化测序需要较高的深度，并且经常需要同时对未处理的原始DNA进行测序比较，因此成本相对较高；同时在基因组中复杂度较低的重复区域中，由于NGS测得的序列较短，存在比对困难，对于这些区域的甲基化状态很难解析。三代测序（SMRT和ONT测序）虽然能够对DNA甲基化状态直接检测，但也存在通量低，成本高的不足。在全基因组光学图谱（OGM）分析中，增加荧光基团标记甲基化或者非甲基化DNA片段，就可以对全基因组范围内的甲基化状态进行研究。由于OGM检测单分子超长DNA片段，在分析低复杂的重复区域中具有先天优势。

ROM标记方案
如图1所示，ROM标记主要有两个步骤（具体条件可参考原文【1】）：

缺刻酶介导的NLR全基因组标记: 抽提的超长片段基因组DNA在缺刻酶作用下在对应的基因组片段上产生缺口。随后利用Taq DNA合成酶进行缺口平移，同时将带有荧光标记基团的dNTP掺入新合成的链中。最后在Taq DNA连接酶的作用下将缺口连接，形成完整的双链。这样荧光标记就在相应的基因组序列motif附近出现。

M.TaqI甲基转移酶介导的荧光标记: M.TaqI甲基转移酶可以在基因组中特定motif(TCGA)的腺嘌呤(A)上转入一个甲基，但是这个反应会受到邻近的CpG中C碱基的甲基化或者羟甲基化影响。也就是说一旦TCGA中的C碱基是被甲基化或者羟甲基化的，该反应就会无法完成。ROM分析将甲基转移反应的底物替换成带有荧光标记的类似物，就可以区分出TCGA中的甲基化状态。

双色荧光标记: 抽提的超长片段DNA首先使用NLR缺刻酶全基因组标记并使用红色荧光标记基团；随后500ng标记好的DNA使用M.TaqI甲基转移酶和绿色荧光底物进行第二轮标记；标记完成后使用蓝色染料对DNA骨架进行染色。随后得到的标记染色后的DNA在Bionano OGM平台上进行电泳和数据收集。

图1 M.TaqI甲基转移酶区分甲基化非甲基化标记原理

ROM可行性验证
为了验证该方法的可行性，研究团队使用ROM 针对FSHD相关区域（D4Z4 repeats）同时进行了拷贝数和甲基化的分析。

FSHD-associated D4Z4 repeats BAC文库测试
将正常人的D4Z4区段转入BAC文库后，研究团队使用多种方法对其进行了分析。

1. 首先使用超高深度（大于15000X）NGS测序，希望利用重复区域和非重复区域的测序深度比例来推测拷贝数。然而作者发现两种区域内部的深度变异也非常大（非重复区域平均差在25%左右，重复区域更是高达63%），推测会造成估算的不准确。最终利用平均深度的比例，NGS预测D4Z4重复次数为8，但是不确定性非常大。

2. 随后使用NLR方法将BAC文库分子标记上红色荧光基团后，在修饰后的玻片上拉直，荧光显微镜下直接观察。通过直接计数标记个数（D4Z4每一个repeat中都有一个标记位点），直观得到了准确的D4Z4重复数为22（如图2）。

图2 左: D4Z4 repeats BAC文库示意图右: 标记后的单个BAC分子

3. 标记后的DNA在Iyrs平台上进行电泳拍照，利用单分子组装成D4Z4区域的完整图谱。通过和参考基因组的比较得到D4Z4 repeats的个数为22 ± 1（图3）。

图3 OGM组装后的分子和图谱，灰色区域为非D4Z4重复区段

4. 最后针对BAC文库进行了ROM分析。作者使用红色荧光来确定基因组标记，绿色荧光来标记甲基化状态。使用非甲基化修饰的BAC文库和部分甲基化的BAC文库显示了非常明显的荧光信号区别（图4），从而证明ROM是一种可行的甲基化分析方案。

图4 甲基化和部分甲基化BAC文库的ROM分析结果

FSHD 家系样本测试在一个FSHD家系中，使用ROM分析了一个病人样本和一个健康亲属样本。基因组组装结果显示在FSHD病人中，致病D4Z4重复数（4qA）为4, 而健康亲属的D4Z4重复数（4qA）为26；两个样本另外一个等位基因均为非致病性的4qB，且重复数为48（图5）。

图5  D4Z4片段重复数，左侧为阳性样本，右侧为阴性样本

ROM分析也发现FSHD阳性样本中，无论是D4Z4重复的单个片段甲基化程度（图6）还是平均甲基化程度（图7）都明显低于阴性样本，从而证明D4Z4重复片段的去甲基化与FSHD疾病的相关。

图6  ROM分析信号，左侧为阳性样本，右侧为阴性样本

图7  ROM分析显示的平均去甲基化程度，左侧为阳性样本，右侧为阴性样本

总结

OGM技术能够结合多种标记手段，ROM为我们展示了结合基因组骨架标记和甲基化标记的分析方案。相信可以期待更多的特异性或非特异性标记技术与OGM骨架标记结合，完成针对不同应用的分析。