外泌体 & miRNA完整解决方案

细胞外囊泡 (extracellular visicles，EV) 是由细胞释放出的携带并保护细胞来源生物信息分子物质的特殊结构，可通过转运核酸和蛋白质等生物信息物质参与体内靶细胞的信号调节，并作为药物或疫苗的载体在抗肿瘤治疗、干细胞治疗等领域发挥关键作用，而其中EV中的RNA分子 (exoRNA) 因其*的表达模式而受到了广泛的关注。

一、外泌体及miRNA纯化

① 外泌体纯化
沉淀法miRCURY®外泌体纯化试剂盒 畅销
※ 从不同起始材料中进行外泌体提取：尿液样本2-10 mL，CSF样本1 mL，细胞培养液 1-10 mL ；血浆/血清0.2-1.4mL
※ 2小时内完成外泌体提取
※ 无需高速离心及酚/氯仿提取
※ 适用于多种应用，如miRNA或RNA profiling

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亲和柱膜法外泌体分离及外泌体内RNA(含miRNA)的纯化
exoEasy Maxi Kit  货号：76064
从血浆、血清、细胞培养上清及其他生物液体中分离完整的exosome及其他细胞外囊泡

※ 适用于囊泡功能性检测及物理和生化分析
※ 可在25分钟内纯化获得exosome及其他细胞外囊泡
※ 离心柱纯化流程，可平行处理多个样品
※ 可处理大体积的样品(4 ml血浆或血清，或32ml细胞培养上清)，灵敏检测低丰度转录本

exoRNeasy Serum/Plasma Kit  畅销
采用亲和性膜离心柱，可从来自血清、血浆、尿液、细胞上清等样本中分离exosome和其他细胞外微泡中高效分离RNA。该试剂盒能够快速、便利的获得结果，十分适用于敏感的下游应用。

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特殊样本外泌体及miRNA纯化试剂盒订购指南

② miRNA纯化：Copurifcation of miRNA and total RNA 
产品特点：
※ 可以单独富集各种组织、细胞样品中的miRNA和其他小RNAs (＞18nt)，做芯片分析时单独分离可能会有帮助 
※ 推荐同步纯化包含miRNA的总RNA，这样有助于一次cDNA合成可以获得所有类型RNA信息，便于同时进行miRNA，mRNA或其他非编码RNA检测
※ 硅胶膜技术确保获得最好纯度miRNA，不会有Trizol方法带来的选择性miRNA丢失，适合各种下游检测

miRNeasy Serum/Plasma Kit (货号：217184)
※ 同样使用经典的硅胶膜法
※ 该试剂盒适用于使用柠檬酸盐或EDTA抗凝的血清 (不能使用肝素，会干扰下游的实验)
※ 保证清洗缓冲液的温度在20-30°C，否则会有盐类的残留
※ 配合使用Spick-in control，对纯化效率及下游检测进行监测

miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit (货号：217204) 畅销
※ 无需Phenol裂解，更易于在QIAcube进行自动化操作
※ 采用UCP MinElute纯化柱，更安全、更小洗脱体积
※ 纯化高品质含胞外/外泌体非编码RNA(miRNA)的总RNA，适合任何下游应用

miRNA纯化试剂盒订购指南

二、miRNA定量

① miRCURY LNA miRNA qPCR检测系统

Exiqon microRNA qPCR系统将通用逆转录的高灵敏度，高效率与锁核酸修饰的定量引物的高特异性相结合，在3个小时之内即可完成microRNA表达分析。miRCURY LNA miRNA qPCR系统可提供assays及panels规格，20ng total RNA无需预扩增即可在96孔及384孔板上进行上百microRNAs的精准定量。miRCURY LNA miRNA qPCR检测系统具有以下特点：
● 高的灵敏度：低至1pg total RNA即可进行可靠的定量
● 高的特异性：LNA引物可精确区分只有一个碱基差异的miRNA异构体
● 实验操作简单方便：在3小时内即可完成从样本到数据分析的整个流程

miRCURY LNA RT kit （货号：339340）
用于一链合成，与miRCURY LNA miRNA PCR Assays / Panels搭配使用效果佳，包含RNA spike-in模板。

miRCURY LNA miRNA PCR Assay / Custom PCR Assay / miRCURY LNA miRNA PCR Panels
200次反应的预制或定制LNA miRNA PCR primers，用于目标miRNA表达水平检测。

miRCURY LNA SYBR Green PCR Kits（货号：339345、339346、339347）
用于qPCR检测，包含ROX染料。

miRCURY LNA miRNA PCR Starter Kit（货号：339320） 爆品
包含该套件包括UniSp6模板及引物，一个候选内源对照引物组（miR-103a-3p）和两个经过验证的引物组（人、大鼠、小鼠），并通过LNA技术进行了增强。这些试剂能够定量分析多达20个样品。

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图1：PolyA尾添加到成熟的miRNA模板中（步骤1A）。使用带有3' degenerate anchor及5' universal tag的PolyT primer进行cDNA合成（步骤1B）。用一对microRNA特异性LNA primer对cDNA进行扩增（步骤2A），使用SYBR® Green或probe进行检测（步骤2B）。

图2：低至1pg total RNA 即可进行精准定量。人 AM6000 total RNA梯度稀释后进行定量，所有的microRNA assay均显示出线性相关R2＞0.99。

② 爱必信miRNA定量分析系列产品
miRNA加尾法和探针法逆转录试剂盒产品特点：
● 基因工程优化的Poly A聚合酶，miRNA Poly A聚合高效快速；
● 特别设计的含Oligo d(T)的引物，能够与miRNA Poly A+高效结合，RT效率高于多家同类试剂；
● 一次逆转录可获得多个miRNA的RT产物，后续可进行多个miRNA的检测，极大节省样本用量；
● 可配套 miRNA加尾染料法荧光定量PCR试剂或者iRNA探针法荧光定量PCR试剂使用，轻松获得优化的实验结果并可免费获得配套的下游引物。

miRNA茎环法逆转录试剂盒产品特点：
● 高效的基因工程优化的逆转录酶，可大幅提升miRNA RT反应的效率；
● 特别设计的茎环引物可高效、特异性地反转录目的miRNA，获得加长的miRNA cDNA，不仅可用于染料法qPCR, 也可用于探针法qPCR；
● 搭配 miRNA茎环染料法荧光定量PCR试剂盒，可获得优化的实验结果并可免费获得茎环引物和上下游引物的设计和序列信息。

miRNA系列产品

三、高通量miRNA定量及筛选

① miRCURY LNA miRNA Focus PCR Panel：集成式筛选多个miRNA 的表达
产品特点：
• 即用型 miRNA PCR panel 专注于特定应用、样本类型或疾病  
• 快速且易于使用，无需预放大
• 高重现性和最小技术变化的简单协议
• 可靠区分密切相关的 miRNA 以及成熟和前体 miRNA

miRCURY LNA miRNA Focus PCR Panel快速索引

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四、microRNA功能研究工具

① miRNA Mimic
 miRNA mimic被设计用来模拟自然发生的、成熟的miRNA。将miRNA模拟物引入细胞将增加含有该特定miRNA的RNA诱导沉默复合物(RISC)的比例。通过研究这种miRNA活性增加的表型后果，有可能发现miRNA的功能。

（1）LNA修饰mimic
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(2)miRIDIAN mimic
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② miRNA Inhibitors and Power Inhibitors
miRNA Inhibitors 是一种反义寡核苷酸，具有与其靶点互补的完整序列。当被导入细胞时，它们将目标miRNA隔离在高度稳定的异源双链体中，有效防止miRNA与其正常细胞相互作用。有三种不同类型的miRNA Inhibitors可供选择。

(1)LNA修饰inhibitor
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对于每种抑制剂，我们提供以下两种对照：
阴性对照A：在NCBI和miRBase数据库中，与任何生物中的任何序列的同源性均不超过70％
阴性对照B：在NCBI和miRBase数据库中，与任何人类，小鼠或大鼠序列的同源性均不超过70％。不建议在植物中使用

(2)miRIDIAN inhibitor
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③ miRNA Target Site Blockers
利用靶位点阻断剂（Target Site Blockers）发挥miRNA的功能，miRNA通常会调节多个靶标的基因表达，并且抑制miRNA会导致所有这些靶标的抑制。因此，miRNA抑制后观察到的表型是几个靶标阻遏作用的综合结果。然而，放松对这些靶标中的一些靶标通常会显着地影响表型。识别这些靶标对于理解miRNA的功能至关重要。靶位点阻断剂使研究人员能够研究miRNA对单个靶标的作用。

使用靶标封闭剂研究 microRNA 的目标区域，从分子角度更有针对性的研究 microRNA 功能。单个目标对所获得的表型的作用可以通过目标位点阻断剂(TSB)进行研究，特异性地阻止了microRNA与其中一个RNA靶点的相互作用。

产品特征：
• 定制设计的目标位点阻断剂，用于特异性抑制 miRNA 目标
• 精巧的设计和优秀的高亲和力，无论目标序列如何
• 优秀的体外和体内功效
• 由于缺乏依赖于 RNase H 的 mRNA 降解，优秀的性能和高蛋白表达
• 在非常低的浓度下有效，在目标位点上胜过 miRNA
• 具有持久反义活性的优秀生物稳定性     

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五、LNA检测探针--NB及原位杂交
① LNA检测探针 — Northern Blotting及原位杂交
针对mRNA、lncRNA或miRNA的定位检测，Exiqon可提供LNA检测探针，序列特异性强，灵敏度高、探针标记方式灵活多样，尤其适合用于Northern Blotting和原位杂交实验，可满足研究者的不同实验需求。

LNA锁核酸探针核心优势
● 优秀的灵敏性和特异性
● 可检测所有已知的mRNA、lncRNA、microRNA，并可支持定制
● Tm均一化探针可实现ISH multiplexing及自动化
● 可提供无标记，预置标记及订制标记形式的探针
● 与放射性及非放射性方法兼容
● 适用于多种样本类型

LNA探针已经成功的使用在多种样本类型中（见图1），包括整体样本（whole-mount），单细胞，冷冻切片及FFPE组织样本等。对于FFPE样本，我们推荐使用miRCURYLNA microRNA ISH Optimization Kits进行优化来调整自己探针的最佳使用量和试剂配比，从而确保自身探针实验的成功。

图1：LNA探针已经成功的使用在多种样本类型中

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六、miRNA 相关转染
① 基于脂质分子的转染试剂--HiPerFect Transfection Reagent （货号：301705）
● 低至 10 pM siRNA的高效转染
● 实现低浓度siRNA的使用，最大限度减少脱靶效应
● 多种贴壁和悬浮细胞，以及原代细胞系已经利用 HiPerFect Transfection Reagent成功转染（精选细胞系详见表1）。
● siRNA 的转染可能引起脱靶效应，产生非特异性的RNAi实验结果。使用低浓度的siRNA，可大大降低脱靶效应。有了HiPerFect Transfection Reagent，低至10 pM siRNA也能观察到高效的转染和沉默，让等量的siRNA可用于更多实验（图1）。

表1 成功转染的细胞系

图1. 皮摩尔siRNA的高效转染。利用HiPerFect Transfection Reagent (3μl),在24孔板中用各种量的CDC2 siRNA和非沉默对照siRNA（对照）转染HeLaS3细胞。48小时后，通过实时定RT-PCR分析CDC2的表达。

② PEI阳离子聚合物转染试剂-- INTERFERin® （货号：101000036、101000028）更少的siRNA，更高的沉默效率，降低脱靶效应！
● 高效基因沉默效率：在多种细胞中达到超过90%的基因沉默
● 极低的脱靶效应：使用低至1nM siRNA
● 温和的转染模式：保持优秀的细胞活率
● 操作简单：兼容血清和抗生素

图注：根据标准操作手册在稳定表达荧光素酶的3LL细胞中进行转染

图注：根据标准操作手册在CaSKi细胞中进行转染

③ 活体转染方案---in vivo-jetPEI®（货号：101000040、101000030）
注射型转染试剂，用于基因治疗和疫苗！

in vivo-jetPEI®的优势：
● 使用便捷：两步操作
● 给药方便：可用于各种注射途径，以达目标
● 量身定制：专家优化的操作方案

in vivo-jetPEI®的介绍：
● 适用于任何动物模型的DNAsi/sh/miRNA活体转染
● 享有盛名：*的活体转染技术，引用文献超过700篇
● 成功的产物：从基础研究到人临床研究（提供GMP级产品）

图注：使用in vivo-jetPEI®在动物模型上的各种给药途径

七、miRNA文库构建

① QIAseq miRNA Library Kit（货号：331502、331505）
基于分子条形码技术的高精度特异性小RNA快速测序文库构建文案
● 采用分子条形码（UMI）技术用于扩增偏倚的去除
● 仅需1ng总RNA，可仅依靠试剂盒内含的磁珠进行纯化而无需切胶回收
● 可用于miRNA，piRNA等Small RNA的表达分析以及全新Small RNA的发现
● 基于qPCR的*miRNA QC系统及外源参照，可用于样本质量以及测序后NGS线性度和可重复性的评估

图注：“gel-free”小RNA快速文库构建流程

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