生物药物工艺相关杂质检测

生物药物杂质可以分为外来污染物和与产品相关杂质两大类，其中外来污染物包括微生物污染、热原、细胞成分、培养基中的成分、来自生产过程中各步骤的物质以及来自纯化步骤的物质等等。各种杂质和数量会影响最终药品的安全性，在其开发过程中对杂质的鉴别、定量、定性和控制以及去除是非常重要的。

今天小编总结了部分相关杂质检测，涉及抗体药研发，细胞治疗和mRNA疫苗等研究领域，敲黑板，做笔记喽...

①双链RNA(dsRNA)残留检测；
②宿主DNA残留检测；
③Protein A 检测；
④BSA残留检测；
⑤CHO宿主蛋白（HCP）残留检测；
⑥E.coli大肠杆菌宿主蛋白（HCP）残留检测

dsRNA残留
在基于酶反应制备mRNA疫苗的过程中，异常的体外转录反应（In vitro transcribed ，IVT）也可能会引入dsRNA污染物。相较于病毒来源的dsRNA，体外反应中生成的dsRNA污染的检测和去除对于RNA疫苗更为重要。混入了dsRNA污染的IVT mRNA会引起强烈的I型干扰素介导的抗病毒反应，上调PKR和OAS等关键酶的表达，导致细胞翻译水平的抑制和细胞内mRNA和核糖体RNA的降解。相应的，引入能高效去除dsRNA污染的FPLC纯化过程，能在原代人DC细胞中1000倍提升IVT mRNA介导的蛋白表达。因此，mRNA疫苗生产过程中合适、有效的IVT mRNA纯化对于DC细胞抗原蛋白的生产非常关键，并能避免不必要的自身免疫反应的激活。

均相时间分辨荧光（TR-FRET）技术使用双抗夹心法检测dsRNA，是替代ELISA和qPCR的一种快速，高灵敏的检测方法。实验全程无洗涤，实现均相二步法检测。该技术凝聚了时间分辨（TRF）和荧光共振能量转移（FRET）两大技术核心，实现检测背景低，高通量，高特异性，高灵敏度，除技术优势外，还具有高性价比，现已受到国际和国内众多mRNA研究客户认可。

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宿主细胞DNA残留
生物制品中的重组蛋白药、抗体药、疫苗等产品是用连续传代的动物细胞株表达生产，虽然经过严格的纯化工艺，但产品中仍有可能残余宿主细胞DNA。病毒性疫苗中宿主细胞残留DNA相关的风险主要是感染性和致癌性，如果存在逆转录病毒前病毒，其基因整合入受者基因组可能导致感染；如果存在病毒或传代细胞基质中的致癌基因，则可能具有引发肿瘤的潜在风险。因此，建立合适的宿主细胞残留DNA的检测方法对监测生物制品的安全性和质量可控性至关重要。

LANCE技术用于分析检测和定量缓冲溶液和细胞培养基中的DNA污染物，利用镧系元素Eu和APC ULight分别作为荧光能量供体和受体，实现荧光定量检测。该技术全程无需洗涤和包被，实验背景低，检测下限54.5 pg/mL，检测范围：54.5– 30,000 pg/mL。EC50: 50.1 ng/mL。

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Protein A残留
Protein A亲和层析在反复使用过程中会产生一定程度的脱落，残留在产品中的Protein A会引起不良免疫应答反应，其和抗体的复合物在体内可激活携带Fc的白细胞和补体系统的免疫应答，产生氧化和过敏反应，一般采用离子交换层析可以去除。美国FDA建议产品中Protein A残留应低于10-12ppm。

针对生物工艺中经亲和柱分离纯化后的药物产品，该试剂盒可以快速简便的测定其中是否含有Natural Protein A from S. aureus (Millipore)，Recombinant Protein A from E. coli (Repligen)，Recombinant Cys-Protein A from E. coli (GE)，Recombinant alkaline-resistant Protein A variant from E. coli (MabSelectSure™）from GE 以及对应的含量。

Enzo ELISA检测Protein A灵敏度可达9.01 pg/ml (<1 ppm)。3小时内完成检测。可检测多品牌来源的Protein A，价格远低于同类产品。在国内已经拥有大量CDMO，药物研发公司类型用户。

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BSA残留
生产生物制剂经常需要进行细胞培养，牛血清白蛋白(BSA)被用作细胞和微生物培养中的一种营养物质。大量的牛血清白蛋白在生产过程中通过洗换、纯化等步骤去除了大部分的BSA，但微量的BSA依然存在于生物制剂成品中。BSA作为异种蛋白进入人体后有可能引起严重过敏反应，影响生物制品的安全性。因此，严格控制制品中BSA的含量是生物制品生产的重点工作之一。除了疫苗之外，细胞治疗、干细胞以及组织工程产品等生物制剂也会进行BSA残留量的检测，保证相关生物制品的安全性。《中国药典》（三部）2020版对各种疫苗BSA的残留量都进行了明确的规定，基本是不高于50 ng/ml。

Bethyl ELISA检测BSA试剂盒采用经典酶联免疫吸附技术，特异性高，检测范围为0.69–500 ng/ml。

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CHO宿主细胞蛋白（HCP）残留
宿主细胞蛋白（HCP）是与过程相关的杂质，由用于生产生物药物蛋白的宿主细胞表达。在纯化过程中，大部分的HCP被去除（> 99％），但残留的HCP量仍保留在分布的产品中，例如单克隆抗体（mAb）、抗体-药物结合物（ADC）、治疗性蛋白质、疫苗，以及其他基于蛋白质的生物制药。诸如FDA和EMA之类的国家法规授权要求必须对生物药品进行分析和纯化，以将宿主细胞蛋白HCP降低到可接受的水平。如美国药典推荐值：终产品的HCP水平1-100 ng/mg。中国药典各论中，CHO细胞HCP应不高于蛋白质总量的0.05% 。

均相时间分辨荧光技术检测宿主细胞蛋白残留灵敏度比传统ELISA高2-5倍的检测方法。检测下限可达0.8 ng/ml，检测范围6.25-400ng/ml，批间差异小，CV值小于10%。稀释线性好，回收率高于98%等优势。

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大肠杆菌宿主蛋白残留
大肠杆菌是应用广泛，成功的表达体系，因此大肠杆菌常被用于重组蛋白生产、基因治疗、细胞治疗以及近几年非常火热的mRNA疫苗生产等。中国药典各论中，E.coli菌体HCP应不高于蛋白质总量的0.10% 。大肠杆菌发酵过程中产生的HCP受到菌株背景、细胞培养条件和重组药物等因素影响，目前没有一个通用试剂盒能够覆盖到到每个HCP检测。

Biogenes大肠杆菌360-HCP ELISA通过不同的抗HCP抗体提供更高特异性和灵敏度，分为四种试剂盒类型（A型，C型，D型，E型），用于优化HCP检测。区别为大肠杆菌抗原遗传背景：BL21（DE3）和W3110和培养基：LB培养基和矿物培养基。

由于难以预测大肠杆菌中的HCP谱，我们建议首先测试所有四种试剂盒类型，然后根据ELISA关键参数（如稀释线性，准确性和覆盖率）选择性能最佳的试剂盒。

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